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| 品牌 | CNtest/中檢維康 | 供貨周期 | 一周 |
|---|---|---|---|
| 應(yīng)用領(lǐng)域 | 環(huán)保,食品/農(nóng)產(chǎn)品,化工,生物產(chǎn)業(yè),綜合 |
1．概要
岡田酸（Okadaic Acid，OA），腹瀉性貝毒DSP 中的主要成分，因從岡田軟海綿中分離出而得名，屬聚醚類海洋生物毒素。低毒類，不能很快救治，尚無致死病例。長期積累可以致畸形及致癌。當(dāng)有毒微藻被雙殼貝類濾食后，OA毒素會在貝類消化腺內(nèi)累積。食用染毒貝類后，患者會出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等急性中毒癥狀。
2．原理
本試劑盒采用間接競爭法。酶標(biāo)板微孔中預(yù)包被岡田酸毒素抗原，樣品中殘留的岡田酸毒素與微孔板上的抗原競爭岡田酸毒素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB顯色，吸光值與樣品中岡田酸毒素含量成負相關(guān)。
3．試劑盒組成
1）包被有抗原的96微孔板：1塊（96孔，12條×8孔）
2）標(biāo)準(zhǔn)品工作液：0、0.2、0.6、1.8、
5.4ng/mL 1瓶x1mL
3）岡田酸毒素抗體： 1瓶x8mL
4）酶標(biāo)二抗： 1瓶x15mL
5) 10x濃縮洗滌液： 1瓶x50mL
6）樣本希釋夜： 2瓶x 50mL
7）顯色底物液（TMB）： 1瓶x17mL
8）終止液： 1瓶x7mL
9）試劑盒說明書
10）質(zhì)檢報告
4．需要的儀器、試劑
1）儀器
酶標(biāo)儀450nm（iELisa全自動酶標(biāo)儀或相當(dāng)者）
離心機
微量移液器20μL～200μL，100μL～1000μL
50mL離心管
8道微量移液器
酶標(biāo)板振蕩器
天平：感量0.01g
2）試劑
去離子水
甲醇
5．樣品處理
5.1貝類樣本
1）去除貝殼取出貝肉，將貝肉樣本均質(zhì)；
2）稱取1.0g均質(zhì)好的樣本于50mL離心管中；
3）加入10mL80％甲醇水，劇烈震蕩5min；
4）室溫4000r／min離心10分鐘；
5）取上清液20μL到980μL樣本希釋夜中，混勻；
6）取50μL混勻液用于檢測。
稀釋倍數(shù)：500
6．酶聯(lián)免疫分析程序
6.1測定之前注意事項
1）使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。
2）使用后迅速將試劑放入2-8℃冷藏。
3）在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4）所有孵育過程應(yīng)避免陽光直射，并按要求用蓋板覆蓋住酶標(biāo)板。
6.2 溶液的配制
1）洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用去離子水稀釋10倍后使用（1份濃縮洗滌液加9去份離子水）。
2） 80％甲醇水的配制：量取80mL甲醇加入20mL 去離子水。
6.3測定程序
1）將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶標(biāo)板架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個平行實驗，記錄下標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置。未使用的酶標(biāo)板用鋁箔袋封好置2-8℃冷藏保存。
2）分別吸取50μL標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加至相應(yīng)的微孔（雙孔）中，然后各加入50μL岡田酸毒素抗體加蓋，室溫溫育30分鐘（每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品必須使用新的吸頭）。
3）倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證除去孔中的液體，然后每孔加入250μL 稀釋好的洗滌液洗滌，振蕩后倒出孔中的液體，拍干；重復(fù)操作四次，洗板時每次間隔30秒，洗完后用力在吸水紙上拍干。
4）加入100μL酶標(biāo)二抗抗體加蓋，室溫溫育30分鐘（每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品必須使用新的吸頭）。
5）倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證除去孔中的液體，然后每孔加入250μL 稀釋好的洗滌液洗滌，振蕩后倒出孔中的液體，拍干；重復(fù)操作四次，洗板時每次間隔30秒，洗完后用力在吸水紙上拍干。
6）每孔加入100μL底物，室溫避光溫育10分鐘。
7）每孔加入50μL終止液，混勻。
8）置于酶標(biāo)儀中，振蕩混勻，在450nm處測定吸光度值（OD值），參比波長630nm。（iELisa 全自動酶標(biāo)儀可以直接讀出、打印濃度值）。
7．結(jié)果判定
1）所獲得的每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)品（0標(biāo)）的吸光度值（Bo）再乘以100％，即百分吸光度值。百分吸光度值
以岡田酸毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度值（ppb）為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。相對應(yīng)每一個樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣本溶液濃度。利用計算機專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。
2）樣品的實際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
3）如果測定值超出檢測范圍，樣品提取溶液按一定的比例用稀釋緩沖液進行稀釋。
8．注意事項
1）室溫低于20℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致數(shù)值偏低。
2）在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥過久的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
3）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對光敏感，避免直接暴露在光線下。
4）混合要均勻，洗板要（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn)液的時候都必需充分混合均勻）。
5）反應(yīng)停止液為強酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。
6）不要使用過期的試劑盒，也不要稀釋或攙雜使用不同生產(chǎn)廠家的試劑盒這樣會引起靈敏度降低。
7）試劑盒的儲存條件是2-8℃，切勿冷凍。
9．檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度、交叉反應(yīng)率
1）精密度：批內(nèi)變異系數(shù)＜10％(n=10)
批間變異系數(shù)<25%(n=10)
2）靈敏度：0.2ng／mL。
3）樣本檢測線：
貝類 100ng/mL
4）準(zhǔn)確度：
貝類 90%±25%
5）交叉反應(yīng)率：
岡田酸 100%